0 引言 Introduction

膝骨关节炎为关节软骨变性、增生引起的慢性退行性骨病，临床主要表现为负重关节疼痛、肿胀或畸形[1-3]。研究显示，炎性因子、胶原分子及蛋白多糖均与膝骨关节炎的疾病进展有关，其中多信号途径诱导的炎性因子的增加可诱导骨细胞外基质降解和软骨细胞凋亡[4-5]。山茱萸为中医治疗骨质疏松的常用配方药物，具有补益肝肾的功效，山茱萸新苷Ⅰ(cornusideⅠ，CorⅠ)为山茱萸的主要有效成分[6-7]，研究显示，山茱萸新苷Ⅰ可促进大鼠成骨和软骨细胞的增殖[8]，对于修复膝骨关节炎早期损坏的软骨可能有显著的治疗意义。因此，实验拟建立膝骨关节炎大鼠模型，探讨山茱萸新苷Ⅰ对早期膝骨关节炎大鼠关节软骨组织形态的影响及对白细胞介素6/信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)信号通路的影响。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2018年1月至2019年5月在广州中医药大学动物实验中心完成。

1.3 材料 健康SPF级七八周龄雄性SD大鼠50只，体质量200-225 g，购自北京维通利华生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2018-4-016。实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：。

山茱萸新苷Ⅰ：cornuside Ⅰ，纯度≥98%，20 mg/支, 成都曼思特生物科技有限公司；塞来昔布：国药准字J，200 mg/粒，批号：BK0，辉瑞制药有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 分组、建模及给药方法 将50只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、山茱萸新苷Ⅰ高剂量组(CorⅠ-H)、山茱萸新苷Ⅰ低剂量组(CorⅠ-L)和阳性对照组，每组10只。除假手术组外，均参照Hulth法制备膝骨关节炎大鼠模型[9-10]：体积分数10%水合氯醛麻醉，切开关节囊显露髌骨，切断大鼠右侧前交叉韧带，以抽屉试验阳性确认造模成功，其中假手术组只切开关节腔，不进行其他处理，随后各组大鼠术后连续3 d腹腔注射青霉素进行抗感染处理。建模成功后高、低剂量干预组分别灌喂1.25，5 g/kg的山茱萸新苷Ⅰ，阳性对照组灌胃4 mg/kg的塞来昔布，假手术组与模型组则灌喂等量的生理盐水，每日1次，连续6周。

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1.4.2 苏木精-伊红染色观察大鼠关节软骨组织病理形态学变化 各组大鼠连续用药6周后，采用体积分数10%水合氯醛麻醉后，解剖双侧膝关节并暴露关节软骨，然后切下左后肢股骨内髁全层软骨，参考文献[11]的方法进行苏木精-伊红染色(北京中杉金桥生物技术有限公司)，40 g/L甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，采用组织切片仪切片(美国Thermo公司)，石蜡包埋制备石蜡标本，随后常规脱蜡，苏木精-伊红染色后在IX71倒置光学显微镜(日本Olympus公司)下观察各组大鼠软骨组织的病理学变化，并依据Mankin’ s法对大鼠软骨组织结构的退变程度进行评分[12]，评分越高表明软骨组织退变越严重。

1.4.3 ELISA检测各组大鼠软骨组织炎性指标 各组大鼠连续6周用药结束后，麻醉下颈椎脱臼处死大鼠，打开关节腔分离关节软骨，使用组织破碎仪，参考文献[13-14]的方法制备软骨组织匀浆，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，分离上清，严格按照白细胞介素1β、肿瘤坏死因子、基质金属蛋白酶13试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作步骤检测软骨组织中上述炎性蛋白表达水平。

1.4.4 免疫组织化学染色检测大鼠关节软骨组织中白细胞介素6及STAT3蛋白表达 各组大鼠软骨石蜡切片脱蜡至水，参考文献[15-16]的方法，热抗原修复，体积分数3% H2O2去离子水阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，加入兔抗白细胞介素6 (1∶1 000)、STAT3 (1∶1 000)单克隆一抗，4 ℃过夜，兔抗鼠二抗 (1∶1 000)37 ℃孵育60 min，DAB显色(北京中杉金桥生物技术有限公司)，苏木精染核，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察，其中白细胞介素6于组织间质，磷酸化STAT3定位于细胞核或胞质，以出现棕黄色颗粒为阳性染色。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对软骨细胞阳性染色的积分吸光度值进行定量分析。

1.4.5 Western blot法测定各组大鼠关节软骨组织JAK2/STAT3信号通路蛋白表达 采集各组大鼠的软骨组织，参考文献[17-18]的方法制备软骨组织匀浆，提取组织总蛋白，BCA试剂盒(南京建成生物工程研究所)蛋白定量。随后常规上样、聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭，随后加入依次加入鼠抗JAK2(1∶100)、p- JAK2(1∶100)、STAT3(1∶100)及p-STAT3(1∶100)单克隆一抗(美国Abcam公司)及辣根过氧化物酶标志鼠抗兔二抗(1∶2 000)，化学底物发光法显色，Chemi Doc XRS + System 凝胶成像仪(Bio-RAD 公司)图像扫描分析，采用Image-QuaNT软件测量其吸光度，以各β-actin为内参对照分析p-JAK2，JAK2，p-STAT3及STAT3的相对表达量，并计算p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3比值。