0 引 言

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的接触性传染病，是最严重的动物疾病之一，其感染期间的临床症状与猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）所见无异，且能够导致高发病率和高死亡率[1]。该病首次发现于肯尼亚，近年来已经传播到欧洲、非洲、美洲等地区[2]。在中国，2018年8月爆发首例ASFV疫情，截至2019年7月，已经确诊了149例疫情，捕杀了超过100万头猪[3]。ASFV这种毁灭性疾病能够造成受感染动物的死亡率高达100%，严重影响了全球养猪业的经济发展，使得2019年猪肉价格上涨了约20%，与2018年同期相比增加30%[4]，同时也严重威胁着食品安全，如“三全食品的灌汤水饺中疑似检出非洲猪瘟病毒核酸阳性”事件的发生。然而, 目前尚无有效的疫苗或者控制方法来预防该疾病的传播，捕杀措施是唯一的防控手段[5]。因此，快速、简便、可靠的ASFV鉴别方法对于疫情控制的具有重大的现实意义。

世界动物卫生组织（Office International des Epizooties, OIE）推荐的ASFV诊断技术[6]如红细胞吸附试验（hemadsorption test, HAD）、免疫吸附试验（immunosorbent assay, ELISA）和荧光抗体试验（fluorescent antibody test, FAT），具有较高的灵敏度，但是这些方法费时费力，限制了其使用推广[7]。近年来，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测技术包括传统PCR、荧光定量PCR以及等温扩增技术由于其高灵敏度和特异性成为应用最广泛的检测手段，同时也是OIE指定的ASFV检测方法之一[8]。荧光定量PCR具有超高灵敏度，但该优点反而使得检测结果容易产生假阳性结果，且对引物和探针的要求较高，需要价格昂贵的专业设备，因此对人员的专业技能要求也相对较高[9]。等温扩增技术虽然克服了对仪器的需求，但其试剂盒的价格昂贵，而且试剂中的气溶胶易污染形成假阳性结果[10]。相比较而言，对于一些地区特别是发展中国家，部分基层实验室和养殖场的设备不完善、资源有限，在灵敏度和特异性能够满足检测需求的基础上[11]，传统PCR技术价格较低，引物设计简单，操作方便，更适合于非专业技术人员。同时，随着便携式PCR仪[12]的开发，传统PCR也能够实现现场检测的需求。

然而，PCR扩增产物的分析技术如凝胶电泳方法，依旧对时间和技术有一定的要求，而作为快速现场分析方法的一种，便携、低成本、易操作的胶体金试纸条已经成为近年来发展的热点[13]，广泛的应用于食品安全和医学检测[14]。目前有很多核酸侧流免疫分析法（nucleic acid lateral flow immunoassay, NALFIA）是将正反引物均标记半抗原，经过PCR扩增后产生双半抗原标记的PCR扩增产物，能够与胶体金（AuNPs）标记的捕获抗体和在检测线上固定的报告抗体进行结合，从而在试纸条上发生显色反应[15]。然而，抗体的价格昂贵且难以保存，金标抗体偶联的过程也较为复杂，这些限制了NALFIA在现场检测中的实际应用[16]。

因此，该研究建立了一种侧流核酸测定试纸条（lateral flow nucleic acid assay, LFNAA），使用胶体金标记的寡核苷酸的捕获探针能够直接检测PCR的扩增产物，在PCR正向引物标记生物素，反向引物标记Spacer C3 和一段寡核苷酸尾巴，形成尾引物，无需昂贵且难以保存的抗体，且解决了复杂的胶体金标记抗体的需求。在这种独特的尾引物的作用下，PCR扩增产生特殊DNA 产物能够与胶体金标记的捕获探针结合，在检测线上显示红色，从而用肉眼观察目标产物的存在。

该研究将传统PCR技术与胶体金试纸条技术相结合，建立了一种通过核酸检测的LFNAA试纸条，仅需一台普通PCR仪，即可实现快速、简便、灵敏的ASFV鉴别（＜2 h），符合基层普通实验室或养殖场等资源有限的实验室中非专业人员的需求，具有巨大应用前景。此外，该技术也将应用于等温扩增技术，以实现更快更简便的现场检测的技术需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2×Taq Master Mix（购自Novoprotein公司）。试纸条的有关材料，包括背板（J-A6）GL04、硝化纤维素膜（CN140）、吸水垫（H-4）（购自Millipore公司）。HAuCl4·4H2O、柠檬酸、TE缓冲液、柠檬酸三钠和链霉亲和素（SA）（购自Sigma公司）。NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl 均为国产分析纯（国药控股化学试剂有限公司）。荧光定量PCR试剂盒（购自Kapa公司）。荧光定量PCR分析采用ABI 7500仪器（购自Applied Biosystems公司）。

1.2 试验用基因片段DNA及核酸样品

参考GenBank中非洲猪瘟病毒主要结构蛋白基因p72基因（GenBank：AY）[17]，由上海生工生物公司合成基因片段。将获得的冻干粉用TE缓冲液溶解，并根据如下公式[18]计算拷贝数，最后得到1.75×1010 copies/μL的ASFV基因片段。